Ученый рассказал, как биологи перешли от "палочек и кружков" к атомным моделям жизни
Петр Лейман, профессор медицинского отделения университета Техаса в Галвестоне и выпускник МФТИ, объясняет, за что была присуждена Нобелевская премия по химии в этом году и рассуждает о том, смогут ли криоэлектронные микроскопы потеснить ускорители частиц в изучении тайн микромира. Мы используем криоэлектронную микроскопию, рентгеноструктурный анализ, другие экспериментальные биофизические методы и моделирование для определения структуры и свойств этих наномашин. Наша цель - научиться манипулировать этими наномашинами и наделить их нужными нам свойствами.
Жак Дюбоше (Jacques Dubochet) научил мир, как делать тончайшие пленки аморфного льда. Их создание позволило нам решить "невозможную" задачу получения изображения биологической молекулы, которая одновременно находится и в воде, и в вакууме колонки электронного микроскопа.
Ричард Хендерсон (Richard Henderson) очень много сделал для усовершенствования микроскопов именно для биологии, описания теоретических и практических возможностей микроскопа и того, как и сколько нужно собрать данных. Йоахим Франк (Joachim Frank) описал математику создания изображения в биологической микроскопии и создал первый большой программный пакет для обработки информации. Постепенно я пришел к выводу, что это ненаучное, обыденное слово абсолютно правильно описывает текущую ситуацию в молекулярной биологии - ее раздела, где ученые пытаются понять работу биологических систем на уровне индивидуальных молекул или даже взаимодействия атомов, из которых эти молекулы состоят.
Исследователи, которые раньше слышали о криоэлектронной микроскопии, но не придавали ей значения, поняли, что сегодня она может дать ответ на большое количество их вопросов. В частности, криоэлектронная микроскопия позволяет определить структуру биологического объекта, его внешний и внутренний вид, а также то, как устроены части этого объекта, - все это важно для понимания того, как он "работает".
Однако криоэлектронные проекты намного сложнее других методов и процедур, которые используются в молекулярной биологии. Много сил и времени, да и финансов и таланта, уходит на приготовление образца, на сбор, обработку и интерпретацию данных. При этом все это завязано на надежную работу микроскопа, который по сложности сейчас приближается к синхрофазотрону, только с большим "характером".
Раньше, в результате всей этой работы ученые ожидали увидеть их биологический объект в виде своеобразного кучевого облака, где каждый бугорок будет соответствовать белковому домену или фрагменту ДНК или РНК и состоять из тысяч атомов. Для того чтобы понять, из чего же этот объект состоит и что там с чем взаимодействует, нужно было определять структуры компонентов другой методикой, которая дает атомное разрешение, например, рентгеноструктурной кристаллографией.
Для последней же компоненты нужно было получать отдельно, кристаллизовать их и решать их структуры, а это уже отдельная песня, причем своя для каждого компонента. Иными словами, раньше молекулярные биологи со всем этим просто не связывались и работали со своими объектами как с некими эфемерными сущностями, рисуя их в виде кружков, овалов и прямоугольников, которые как-то прикреплены друг к другу.
Криоэлектронная микроскопия сегодня дает возможность увидеть биологический объект с разрешением 0,2-0,4 нанометра, что позволяет построить атомную структуру всего комплекса, минуя другие методы. Финансовые затраты на типичный проект не изменились, а, пожалуй, возросли, так как микроскопы стали сложнее и дороже.
С другой стороны, конечный результат просто нельзя сравнить с тем, что ожидалось раньше. Только структура объекта, к примеру, важного канцерогенного или вирусного белка, на атомном разрешении может открыть дорогу для новой фармакологии, химии и новой физики, когда поведение этого объекта можно будет описать, опираясь на фундаментальные законы природы. Во-первых, компания FEI (сейчас - ThermoFisher) начала серийный выпуск микроскопов Titan Krios, у которых был принципиально новый дизайн оптической системы и, что не менее важно, новая, роботизированная система загрузки образцов.
Этот микроскоп создавался с идеей долгосрочного автономного сбора данных. Во всем микроскопе поддерживался очень высокий вакуум и стабильность, которая позволяла сеткам с тончайшим, аморфным, метастабильным льдом при температуре около минус 180 градусов Цельсия поддерживать свое состояние в течение недель.
К сожалению, первые образцы этих микроскопов были очень ненадежны и не работали месяцами. Приблизительно в то же время или чуть позже появились новые детекторы электронов, которые записывали электронный пучок прямо на силиконовый чип, так называемые "прямые детекторы". Так же, как и с микроскопами, некоторое время ушло на то, чтобы эти детекторы стали надежными и более производительными.
Настоящий качественный скачок, или революция, произошел три-четыре года назад, когда прямые электронные детекторы достигли быстродействия, позволяющего им регистрировать отдельные электроны. При этом ни один из рассеянных электронов не теряется в этом процессе, все они принимают участие в создании изображения на детекторе. Это важно потому, что в результате создания изображения под действием пучка электронов биологический образец очень быстро разрушается.
Это излучение достигает интенсивности эпицентра ядерного взрыва, и образец в таких условиях, естественно, быстро разрушается и "плывет", так как окружающий его аморфный лед деформируется. Можно сказать, что раньше мы пытались фотографировать быстро движущиеся и горящие машины при помощи камеры с долгой экспозицией.
Мы не могли уменьшить выдержку, потому что не будет видно вообще ничего, а увеличить дозу электронов было нельзя, так как наши объекты, состоящие из легких атомов, просто испарялись. Новые детекторы, которые появились четыре года назад, при каждой экспозиции записывают короткий "кинофильм", состоящий из десятков или сотен кадров, на каждом из которых почти ничего не видно, так как их экспозиция очень мала.
При помощи компьютера эти кадры можно наложить друг на друга так, что возможно почти полностью убрать размазывание "картинки". Кроме того, благодаря 100%-му "улову" электронов, мы можем получать идеальные фотографии, качество которых ограничивается только возможностями микроскопа, а не удачей, как было раньше.
С другой стороны, надо понимать, что каждая такая фотография - это всего лишь один, двумерный "срез" трехмерного объекта. Чтобы восстановить третье измерение, нужно собрать очень много фотографий объекта с разных ракурсов.
Именно здесь важна стабильность микроскопа и автоматизация манипуляций образца, что мы приобрели, когда появились системы Titan Krios. Именно эти технологические нововведения позволили криоэлектронной микроскопии выйти на теперешний уровень. Конечно, много произошло в области обработки изображений, но это все вторично, так как, в отличие от художественных фильмов, никакой алгоритм не вытащит что-то новое из фотографии, в которой просто нет информации высокого разрешения! Для криоэлектронной микроскопии образец не нужно кристаллизовать, а это представляет собой серьезную или неразрешимую проблему для больших объектов и комплексов. С другой стороны, криоэлектронная микроскопия - очень дорогой метод проведения исследований по сравнению с кристаллографией.
Рентгеноструктурный анализ белков сейчас оптимизирован на многих уровнях - в смысле финансовых и временных затрат - для работы с небольшими белками. Кроме того, что очень важно для медицины, рентгеноструктурный анализ позволяет точно подтвердить, что атомная модель полностью соответствует рентгеноструктурным данным.
Для криоэлектронной микроскопии эти методы только разрабатываются, так как такой проблемы раньше не было - не существовало такого количества атомных моделей, которые целиком основываются на электронномикроскопических данных! Пожалуй, стоит упомянуть, что сейчас работа с небольшими белками в криоэлектронной микроскопии очень трудоемка, да и пока нужный результат - достижение атомного разрешения - ничем не гарантирован.
В заключение хотелось бы сказать, что в белковой кристаллографии существует очень много процедур и технологических разработок для быстрого исследования большого количества образцов, что очень важно для поиска и создания новых лекарств. Например, для сбора данных на синхротронах используются роботизированные "руки", которые по быстроте и точности своей работы превосходят роботы, которые показывают в голливудских фильмах. Поэтому два метода будут сосуществовать еще очень долго и так может быть всегда в обозримом будущем. Именно эту информацию и дает криоэлектронная микроскопия. Кроме того, изучаемый объект во время подобной процедуры фотографируется сотни тысяч, а то и миллионы раз, что важно для понимания механизмов его работы.
Например, фермент АТФаза, отвечающий за производство АТФ, биологической энергетической валюты, напоминает собой настоящий мотор, в котором есть ротор, статор и прочие его элементы.
Используя криоэлектронный микроскоп, мы можем поймать этот мотор в разных состояниях его цикла и детально изучить структуру. Не так давно мы определили структуру "базальной пластинки" бактериофага Т4 - вируса, убивающего кишечную палочку и похожего по форме на лунный модуль программы "Аполлон" - до и после того, как он прикрепляется к клетке. Наша статья была опубликована в журнале Nature.
Теперь мы работаем над детальным описанием того, как движется каждый из миллиона атомов, образующих эту наномашину, в процессе прикрепления вируса к клетке. Мы пока далеки от понимания физики, которая описывает такие системы, но по мере накопления информации мы приближаемся к возможности описания объектов такого размера на уровне отдельных атомов. Криоэлектронный микроскоп - очень дорогостоящий и "нежный" инструмент. Детекторы, которые произвели революцию, описанную мной выше, стоят сейчас почти столько же, сколько стоит новый электронный микроскоп средней руки - около миллиона долларов.
Вдобавок криоэлектронный микроскоп требует специального обращения, так как работа ведется с электронным пучком очень низкой интенсивности. Приготовление криообразцов, ледяных пленок толщиной 100 нанометров или меньше, в тысячу раз тоньше волоса, - это искусство, которому люди учатся годами.
Поэтому мне видится, что школьники и энтузиасты должны будут подавать заявки на использование криоэлектронных микроскопов в каких-то специализированных центрах. Однако сейчас и в ближайшем будущем время на микроскопах, которые выдают данные с разрешением лучше четырех ангстрем, целиком и полностью занято фундаментальными и прикладными исследованиями.
Чтобы попасть на один из таких микроскопов, нужно стоять в очереди несколько месяцев, а то и год, если учесть скорость приготовления и рассмотрения заявок. Кроме того, заявка должна содержать предварительные данные, показывающие, что образец потенциально содержит информацию высокого разрешения.
Тем не менее технологии развиваются стремительно, новые микроскопы вводятся в эксплуатацию, компьютеры становятся быстрее, ускоряя обработку данных, и не исключено, что в скором времени такие аппараты станут более доступны для всех.
